近期，上海大学转化医学研究院苏佳灿教授团队在期刊 Journal of Nanobiotechnology 上发表研究性文章："Folic acid-modified ginger-derived extracellular vesicles for targeted treatment of rheumatoid arthritis by remodeling immune microenvironment via the PI3K-AKT pathway"。该研究通过差速离心和蔗糖密度梯度离心相结合的方法成功分离了GDEVs，并与FA-PEG2000-Chol相结合制备FA-GDEVs，从而赋予其M1巨噬细胞靶向的能力。通过Zeta电位、透射电子显微镜（TEM）、纳米粒子跟踪分析（NTA）分别对GDEVs和FA-GDEVs的表面电荷、形貌和粒径进行表征，证明此工程化方法不会显著影响GDEVs的形态、尺寸和分散稳定性。高效液相色谱法（HPLC）证实在GDEVs中检测到6-姜辣素和6-姜烯酚。生姜的这些活性成分，以其有效的抗炎特性和多方面的分子靶点而闻名。这一发现提示PEVs可能保留了植物的天然功能，值得进一步探索。上海大学转化医学研究院韩瑞娜硕士研究生、周东阳博士后、纪宁博士研究生、上海中冶医院尹志峰主治医师为论文共同第一作者，上海大学转化医学研究院苏佳灿教授、南通大学附属医院韩庆林主任医师、上海大学转化医学研究院刘晗副研究员、刘心如副研究员为论文共同通讯作者。

研究背景

类风湿关节炎（Rheumatoid arthritis, RA）是一种自身免疫性炎症疾病，以持续性滑膜炎症及后续的关节功能损伤为特征。尽管已有多种传统疗法应用于临床，但这类疗法往往存在显著副作用，且治疗成本高昂。植物源细胞外囊泡（Plant-derived extracellular vesicles, PEVs）因其具备来源丰富、价格低廉、免疫原性低、生物相容性高及可规模化生产等优势，成为极具潜力的替代治疗方案。PEVs可通过转运固有生物活性分子，实现细胞间通讯功能的增强。

文章亮点

材料创新：以天然来源的生姜来源的细胞外囊泡（Ginger-derived extracellular vesicles ,GDEVs）为治疗载体，并对其开展工程化修饰以提升疗效。该方案克服了传统治疗手段的局限性，为疾病治疗提供了一种极具前景的策略。

工程化修饰：基于巨噬细胞表面的叶酸受体对GDEVs进行靶向修饰，实现其在炎症关节部位的高效滞留。该策略借助免疫微环境调控作用，可显著延缓疾病进程，对本领域相关研究具有重要的借鉴意义。

理念创新：首次提出将PEVs应用于RA的治疗方案，再次印证了动植物跨界通讯的全新模式，以及天然物质调控疾病治疗的新机制。该研究不仅为RA乃至其他疾病的治疗提供了全新策略，同时也为PEVs领域的进一步探索提供了研究思路与方向。

该研究通过差速离心和蔗糖密度梯度离心相结合的方法成功分离了GDEVs，并与FA-PEG2000-Chol相结合制备FA-GDEVs，从而赋予其M1巨噬细胞靶向的能力（图1A）。通过Zeta电位、透射电子显微镜（TEM）、纳米粒子跟踪分析（NTA）分别对GDEVs和FA-GDEVs的表面电荷、形貌和粒径进行表征，证明此工程化方法不会显著影响GDEVs的形态、尺寸和分散稳定性（图1B-D）。高效液相色谱法（HPLC）证实在GDEVs中检测到6-姜辣素和6-姜烯酚（图1E）。生姜的这些活性成分，以其有效的抗炎特性和多方面的分子靶点而闻名。这一发现提示PEVs可能保留了植物的天然功能，值得进一步探索。

图1

FA修饰使GDEVs对M1巨噬细胞过表达的FR具有特异性结合能力。荧光显微镜和流式细胞术显示，LPS + IFN-γ激活的BMDMs对FA-GDEVs的摄取显著高于未修饰GDEVs。免疫荧光染色确认了FA-GDEVs与FR的高度共定位，证实了FR介导的内吞作用（图2A-C）。在胶原诱导关节炎（CIA）小鼠中，荧光FA-GDEVs显示出更强且更持久的关节荧光信号，特别是在注射后12小时达到峰值，表明其延长了体内循环时间。离体成像和踝关节切片免疫荧光分析进一步证明了FA-GDEVs在炎症关节中的高效积累和FR共定位（图2D-G）。

图2

在免疫微环境中，细胞、细胞因子等的互动维持免疫稳态和调节炎症。RA中M1/M2巨噬细胞失衡导致促炎细胞因子过量而抗炎细胞因子减少。调整巨噬细胞极化是转向疾病缓解的关键。作者研究了FA-GDEVs对巨噬细胞极化的影响，通过免疫荧光、流式细胞术、WB和qRT-PCR发现在LPS + IFN-γ刺激后，BMDMs中M1巨噬细胞标记物iNOS表达增加；而FA-GDEVs处理显著降低了iNOS，并增加了M2巨噬细胞标记物CD206的表达，效果优于其他处理组（图3A-E）。模拟炎症滑膜环境的研究进一步证实，FA-GDEVs可减弱iNOS表达并增强CD206表达，展示出强大的免疫调节作用，有效促使巨噬细胞从M1向M2极化，从而减轻炎症反应（图3F）。

图3

EVs通过转移内源性miRNAs促进细胞间通讯调节基因表达。作者对GDEVs和FA-GDEVs进行了miRNA测序，发现前20个高表达miRNAs在两者间无显著差异，且富含姜来源的miRNAs，表明PEVs可递送活性植物核酸至哺乳动物细胞。进一步研究显示，FA-GDEVs中的人类miRNAs如has-miR-22-3p、has-miR-143-3p等参与了炎症疾病的免疫反应调控。GO分析揭示这些miRNAs与蛋白自磷酸化、转录调控等功能相关；KEGG分析表明它们参与PI3K-Akt通路，影响巨噬细胞M1到M2极化（图4A-B）。为了验证FA-GDEVs的作用机制，使用WB检测到其处理后PI3K和AKT磷酸化水平增加，伴随iNOS和CD206表达提升。加入PI3K-AKT抑制剂LY294002后，FA-GDEVs的效果消失，免疫荧光染色结果一致（图4C-E）。

图4

作者评估了FA-GDEVs在CIA小鼠模型中的疗效，使用甲氨蝶呤（MTX）作为阳性对照。治疗结束时的照片显示，FA-GDEVs显著缓解RA症状，优于GDEVs和MTX（图5B）。组织学检查发现，CIA组有明显炎症细胞浸润、滑膜炎和软骨退化；而FA-GDEVs组病理改变最小，接近野生型水平（图5C）。临床评估表明，FA-GDEVs治疗的小鼠关节炎症和足跖水肿最轻，疾病进展减缓（图5D-E）。脾脏和胸腺指数分析显示，FA-GDEVs和MTX组与野生型相似（图5F）。FA-GDEVs显著降低了促炎细胞因子TNF-α、IL-6和IL-1β的水平，并减少了破骨细胞计数，促进骨修复（图5G-H）。micro-CT成像证实，FA-GDEVs改善了骨侵蚀，恢复了BV/TV、Tb和BS/BV比率至正常水平（图5I-J）。免疫荧光染色显示，FA-GDEVs显著降低M1巨噬细胞水平，增强M2巨噬细胞水平（图5K）。

图5

最后，本研究通过H&E染色评估了FA-GDEVs对小鼠主要器官的影响，未发现明显毒性或组织损伤（图6A）。此外，FA-GDEVs静脉给药无溶血作用，并能有效减轻RA相关的体重下降（图6B-C）。

图6

总结与展望

苏佳灿教授团队在EVs领域具有丰富的研究经验，已经发表了多篇细胞外囊泡相关的高水平论文，包括MEVs，BEVs、PEVs和OEVs等。此前，苏佳灿教授团队在Nano Research上发表了题为“Engineered plant extracellular vesicles for autoimmune diseases therapy”的综述文章（2024年度封面文章），系统介绍了PEVs的生物发生、理化和生物学特性、内化机制、分离方法及其在各种疾病中的应用，并特别关注其在AID中的潜在作用，全面总结了PEVs的工程化方法和给药途径，展望了利用PEVs在AID治疗中的优势和挑战，此工作奠定了夯实的基础。

该研究通过开发针对活化巨噬细胞的GDEVs（即FA-GDEVs），引入了一种治疗RA的创新方法。作为强效的天然免疫调节剂，FA-GDEVs在CIA小鼠模型中显示出显著缓解RA症状的能力。这种有益效果归因于通过 PI3K-AKT通路调节了M1巨噬细胞的极化，从而促进了向M2巨噬细胞表型的转变。该研究首次阐明了利用GDEVs治疗RA的功能机制。这种调控机制可能超越RA的范围，涵盖一系列以巨噬细胞参与为特征的疾病。FA-GDEVs能够作为一类新型生物活性药物出现，凸显了植物疗法在调节免疫反应方面的新兴意义。这为前瞻性研究和临床应用提供了一个良好的途径。