近期，上海大学转化医学研究院苏佳灿教授团队在期刊 Matter 上发表研究性文章："Immune-instructive bone organoids via non-immunogenic plant-based bioinks for enhanced bone repair"。本研究构建芦荟–纳米黏土复合生物墨水，实现持续M2免疫调控与成骨协同，促进骨类器官整合与修复。未来将优化配方与规模化制造，拓展至皮肤、血管、软骨等免疫敏感组织，并结合芯片/大动物验证加速转化。上海大学转化医学研究院张源硕士、汪拂晓博士后，上海交通大学医学院附属新华医院李瑞阳博士后，上海大学转化医学研究院黄丹硕士研究生为论文共同第一作者，上海大学转化医学研究院苏佳灿教授、任肖湘副研究员，上海交通大学窦红静教授，上海交通大学附属仁济医院曹浈萍研究员为论文共同通讯作者。

研究背景

基于类器官的骨再生策略能够在体外重建原生组织的多细胞结构与动态微环境，因此在修复骨缺损方面展现出独特优势。然而，其临床转化仍受到两大关键瓶颈制约：一是对动物来源、潜在免疫原性基质（如 Matrigel）的依赖，二是体系自身免疫调控能力有限。为此，我们提出一种植物来源的生物墨水体系，由芦荟凝胶、Laponite 纳米黏土与 GelMA 组成，具备非免疫原性、无动物源（xeno-free）及无需外源细胞因子（cytokine-free）的特征，可用于构建“免疫指令型”骨类器官。

本文亮点

骨再生需要免疫反应与成骨过程之间高度协同的相互作用，但当前的类器官与生物材料策略仍在很大程度上依赖于作用短暂的细胞因子，或具有免疫原性的动物来源基质。本研究提出一种“免疫指令型”骨类器官，采用由芦荟凝胶、纳米黏土和 GelMA 组成的无动物源（xeno-free）、无细胞因子（cytokine-free）生物墨水。该生物墨水可在材料内源信号驱动下，使巨噬细胞稳定向 M2 表型极化并维持超过 28 天，同时促进间充质干细胞成骨分化、细胞外基质成熟以及血管化组织的有序组织化。借助这种免疫调控与组织调控的一体化能力，所构建的骨类器官在体内实现了强效矿化，并显著提升颅骨缺损修复效果。以未经加工的芦荟作为核心基质，标志着向“植物来源免疫活性生物墨水”的概念性转变，其在可重复性、生物安全性与临床规模化方面具备优势，有望克服 Matrigel 体系的固有限制。该平台为构建大体积、功能化且具免疫响应能力的骨类器官提供了基础，并在骨缺损治疗转化方面展现出强大潜力。除骨科领域之外，这种由材料编码的免疫指令策略亦可能拓展至皮肤、血管、软骨等对免疫微环境高度敏感的组织，为下一代再生医学开辟新的机会。

图1. 免疫指令型骨类器官示意图。(A) 与 (B) 骨类器官的构建流程及其在骨缺损修复中的应用概览。(C) 骨类器官中免疫调控与成骨作用的机制示意。

图2. 芦荟基纳米复合生物墨水的开发、表征及可打印性评估。(A) 示意图。(B) 不同组生物墨水的 G′ 与 G″ 随温度变化的响应。(C) 各类生物墨水的 G′ 与 G″ 对比。(D) 打印支架样品的杨氏模量（n=3，数值=均值 ± 标准差；单因素方差分析（one-way ANOVA）多重比较检验）。(E) 打印支架样品的压缩应力–应变曲线。(F) 生物墨水黏度随剪切速率变化曲线。(G) 不同生物墨水的成丝性及骨髓间充质干细胞（BMSCs）在生物墨水中的分布（红色箭头表示 BMSCs）。(H) 3D 打印模型的外观展示。(I) 各生物墨水配方的扩散速率与可打印性评估。(J) 扫描电镜（SEM）图像。(K) 支架的能谱（EDS）图像。(L) X 射线衍射（XRD）谱图。(M) 傅里叶变换红外（FTIR）谱图。

我们对芦荟凝胶进行了系统表征，发现其表面具有多孔微结构，并富含多种天然活性分子（如具有抗菌抗炎作用的 phytosphingosine 等），提示其具备抗氧化与免疫调控潜力。我们将芦荟凝胶与纳米黏土引入 GelMA，构建出兼具“生物活性 + 可打印性”的复合生物墨水，并优化得到 GelMA/1% 纳米黏土/40% 芦荟的最佳配方。该墨水表现出明显剪切变稀与稳定凝胶行为，黏弹性和力学性能显著提升，使挤出更连续、结构更清晰，可稳定打印规则多孔支架并提高孔隙连通与物质扩散能力；同时，纳米黏土还增强了热稳定性并实现更可控的降解（可支撑至约 28 天）。总体而言，这一芦荟基复合生物墨水为长期培养与功能构建骨类器官提供了可靠材料基础。

图3. 采用 GelMA、GelMA/Nano 与 GelMA/Nano/AV 生物墨水构建的生物打印骨类器官在 28 天培养过程中的体外成骨诱导。(A) 3D 生物打印 BMSCs 的活/死染色荧光图像。(B) 活/死比例统计。(C) CCK-8 结果（n=8，数值=均值 ± 标准差；双因素方差分析（two-way ANOVA）多重比较检验）。(D) ALP 染色与茜素红（Alizarin Red S, ARS）染色分析的代表性图像。(E) 体外培养骨类器官的 ARS 与 ALP 染色及 Micro-CT 成像。(F) qRT-PCR 分析 mRNA 表达水平（n=3，数值=均值 ± 标准差；单因素方差分析（one-way ANOVA）多重比较检验）。(G) Micro-CT 图像的定量分析，包括 BV/TV、Tb.N 与 Tb.Th（n=3，数值=均值 ± 标准差；单因素方差分析（one-way ANOVA）多重比较检验）。

图4. GelMA、GelMA/Nano 与 GelMA/Nano/AV 生物打印骨类器官在体内培养形成及多细胞分化表现。(A) 骨类器官体内培养流程示意图。(B) Micro-CT 图像的定量分析，包括 BV/TV、Tb.N 与 Tb.Th（n=3，数值=均值 ± 标准差；单因素方差分析（one-way ANOVA）多重比较检验）。(C) 不同组在体内培养 14 天与 28 天的明场照片及 Micro-CT 图像。 (D) 体内培养 14 天与 28 天后，OCN、Runx2、CD31 的免疫荧光染色。(E) 体内培养 14 天与 28 天后，periostin、I 型胶原（collagen I）与 vinculin 的免疫荧光染色。

为评估矿化骨类器官的形成，我们从体外成骨分化到体内组织重塑进行了系统验证：将骨髓间充质干细胞（BMSCs）包埋于不同生物墨水并3D打印成支架后，活/死染色与CCK-8结果显示各组均具良好细胞相容性，其中 GelMA/Nano/AV 支架最有利于细胞黏附与伸展；在体外成骨诱导中，该组 ALP 与ARS染色更强、钙结节更丰富，同时 BMP-2、Runx2、OPN、OCN 等成骨基因显著上调。进一步的Micro-CT监测（培养14/28天）表明矿化随时间累积，28天时 GelMA/Nano/AV 组矿物沉积最显著且分布更均匀，BV/TV、Tb.N、Tb.Th 等指标均达到最佳。皮下植入实验同样证实其体内成骨能力：支架结构稳定、矿化持续增加，并形成更致密、互联的类松质骨小梁结构。组织学与免疫荧光进一步显示该组支架内部细胞充分浸润、坏死区域更少，OPN/Runx2/OCN/COL1与periostin等基质与成骨标志物更强且更均匀，vinculin提示细胞-材料黏附与力学传导活跃；尤为关键的是 CD31 显示仅在含芦荟组形成并向内延伸的微血管网络，从而支撑长期存活与组织功能化。

图5. 类器官对巨噬细胞的调控作用。(A) 体外巨噬细胞调控实验示意图。(B) 流式细胞术数据的统计分析（n=3，数值=均值 ± 标准差；单因素方差分析（one-way ANOVA）多重比较检验）。(C) 采用 iNOS 与 CD206 对巨噬细胞进行联合标定，并通过流式细胞术（FCM）分析。(D) 与类器官支架共培养后巨噬细胞的免疫荧光定量分析（n=5，数值=均值 ± 标准差；单因素方差分析（one-way ANOVA）多重比较检验）。(E) 与体外培养类器官共培养后巨噬细胞的免疫荧光染色。(F) 骨类器官长期调控效应示意图。(G) 与骨类器官共培养后巨噬细胞的免疫荧光定量分析（n=5，数值=均值 ± 标准差；单因素方差分析（one-way ANOVA）多重比较检验）。(H) 不同组中 CD206、IL-10、iNOS 和 IL-1β 的 mRNA 水平 qRT-PCR 分析（n=3，数值=均值 ± 标准差；单因素方差分析（one-way ANOVA）多重比较检验）。(I) 与体内培养类器官共培养后巨噬细胞的免疫荧光染色。(J) 体内培养 14 天与 28 天后，CD206 与 iNOS 的免疫组织化学荧光染色。

为验证骨类器官的免疫调控能力，我们首先用 Transwell 共培养模拟“免疫细胞被材料吸引并进入支架”的过程：将体外培养 1 天的类器官支架置于下腔、RAW264.7 巨噬细胞置于上腔，结果显示 GelMA/Nano/AV（芦荟+纳米黏土）组显著增强巨噬细胞迁移与跨膜浸润；即便在膜上铺设明胶模拟 ECM 屏障，GelMA/Nano/AV 仍保持最高穿越数量。巨噬细胞直接接种到支架上后，该组不仅黏附/增殖更强，还能深入孔隙并长期存活，为持续免疫调控奠定基础。进一步在“反向 Transwell”体系中，我们观察到 GelMA/Nano/AV 可将巨噬细胞主动重编程为修复型 M2 表型：M2 标志 CD206 上调、M1 标志 iNOS 下调，M2/M1 比值显著升高，并伴随 IL-10 等抗炎因子增强；更重要的是，这种效应在类器官成熟后依旧稳定，培养 28 天的构建体再次共培养仍能持续驱动 M2 极化。机制层面，28 天体内植入后的 RNA-seq 显示 GelMA/Nano/AV 诱导广泛转录重塑：成骨相关基因（如 COL1A1、ALPL、BGLAP）与免疫调控因子（如 IL10、STAT6、CD163）同步上调，富集分析提示 免疫通路是核心效应，并将巨噬细胞–T 细胞轴偏向 Th2/抗炎再生、抑制 Th17/促炎信号。整体而言，这种芦荟复合骨类器官并非“被动兼容免疫”，而是作为免疫指令型构建体，同时实现免疫稳态重塑与成骨修复协同，为慢性或免疫敏感骨缺损的再生治疗提供了新策略。

图6. 植入后 4 周与 8 周新生骨形成的 Micro-CT 与组织学评估。(A) 颅骨缺损模型及骨类器官植入的示意图（n=6；每组每只大鼠建立 2 个相互独立的颅骨缺损）。(B) SD 大鼠缺损区域的 Micro-CT 三维重建图像。(C) Micro-CT 图像的定量分析，包括 BV/TV、Tb.N 与 Tb.Th（n=5，数值=均值 ± 标准差；单因素方差分析（one-way ANOVA）多重比较检验）。(D) 颅骨切片的组织学染色结果，包括 H&E、OCN、Runx2、CD206/F4/80 以及 iNOS/F4/80 染色。(E) 颅骨缺损切片中 OCN、Runx2、CD206 与 iNOS 表达的定量分析

我们在大鼠颅骨缺损模型中系统评估了骨类器官的体内治疗效果与生物安全性。Micro-CT 显示，植入后 4 周与 8 周 GelMA/Nano/AV（芦荟+纳米黏土）组缺损填充最充分、骨再生最显著，BV/TV、Tb.N、Tb.Th 等指标明显高于对照组，8 周时优势更为突出，提示新生骨矿化与结构重塑更强。组织学结果一致：H&E 显示该组新骨长入更致密有序、炎症浸润更少；Masson 及成骨标志物（OPN、Runx2）染色也进一步证明成骨活性增强。免疫微环境方面，CD206/F4/80 与 iNOS/F4/80 染色提示 芦荟组以修复型 M2 巨噬细胞为主、促炎 M1 显著减少，而 GelMA 组更偏向 M1 反应。值得注意的是，将 体内成熟 28 天的骨类器官植入缺损后的修复效果优于仅体外培养 3 天的打印支架，说明“类器官成熟度”可进一步提升疗效。与此同时，我们通过皮下植入评估了安全性与降解：主要脏器 H&E 未见病理损伤或炎症，血常规与肝肾功能等指标均处于正常范围，提示无系统毒性；荧光示踪表明 GelMA/Nano/AV 降解更平稳、维持时间更长，与修复期所需的力学支撑相匹配。

总结与展望

本研究构建芦荟–纳米黏土复合生物墨水，实现持续M2免疫调控与成骨协同，促进骨类器官整合与修复。未来将优化配方与规模化制造，拓展至皮肤、血管、软骨等免疫敏感组织，并结合芯片/大动物验证加速转化。