在全球老龄化人口背景下，诸如骨质疏松症、骨关节炎、骨肿瘤等骨科疾病构成了重大的公共卫生挑战。骨组织不仅包含多种骨细胞，还涉及多种细胞类型之间由多个信号通路调控的复杂相互作用。这种复杂性对骨再生疗法构成了重大挑战，使得为具有不同临床表现的患者提供个性化和有效护理变得具有挑战性。在此背景下，骨类器官作为一种从干细胞衍生的3D自组装结构，模仿了人类骨的细胞多样性和空间组织，为研究疾病机制、开发疗法和实现个性化医疗方法提供了有价值的工具。基于此，上海大学苏佳灿教授团队提出了构建骨类器官的通用方法，其通过将骨髓来源的间充质干细胞（BMSC）与水凝胶混合，制备仿骨基质的生物墨水，并结合光固化3D打印技术, 成功构建3D打印支架。该支架植入体内后可自发矿化和成熟，形成完全分化和血管化的骨组织，为骨骼生物学中的研究和治疗应用提供了新的见解。
首先，作者通过示意图描述了该方法，展示了该生物墨水的制备过程：通过化学反应将明胶、海藻酸钠和羟基磷灰石交联，与BMSC混合后，形成了具有骨基质特性的水凝胶，并通过3D生物打印技术，打印出了具有方形空隙的圆柱形支架（图1A-B）。随后将该支架植入裸鼠皮下，利用体内环境促进骨类器官的成熟和矿化，并通过多种技术对骨类器官的矿化、血管化和细胞分化进行评估（图1C）。
接着，作者对该仿骨基质复合羟基磷灰石生物墨水进行了表征。X射线衍射（XRD）分析显示了其与标准羟基磷灰石图谱相符的特征衍射峰，证实了羟基磷灰石的成功合成。扫描电子显微镜（SEM）图像展示了生物墨水中的疏松多孔结构，有利于细胞的长入（图2B-C）。能量色散X射线光谱（EDS）分析显示了碳（C）、氧（O）、磷（P）和钙（Ca）的特征峰，表明有机成分和无机成分共存，元素分布图显示了这些元素的均匀分布（图2E-F）。
随后，研究者展示了骨类器官的3D生物打印过程及其评估结果。通过数字光处理（DLP）3D打印技术，将生物墨水逐层打印并进行光固化处理，成功构建了预设的多孔3D结构（图3A-C）。进一步，通过活死染色和细胞骨架染色，评估了骨类器官在体外培养后的细胞活力和细胞形态。结果显示，骨类器官在体外培养后展现出良好的细胞活力，细胞形态完整，细胞间连接紧密（图3D-E）。
Micro-CT扫描显示，骨类器官在培养20天和40天后呈现出明显的矿化过程。通过不同切面和3D全景成像对矿化过程进行观察，观察图像的颜色变化反映了矿化密度的差异。具体而言，培养20天后，部分区域开始出现黄色（矿化部分），这标志着初始矿化的形成；而到了40天时，黄色区域显著扩大，表明矿化程度有了显著的提升（图4）。
作者进一步对骨类器官进行了深入的形态学和结构分析。SEM观察结果显示骨类器官具有松散多孔的微架构，并且在内部观察到多种形态的细胞，包括相对圆形的细胞和不规则形状的细胞簇。结合先前的文献进行对比分析，初步推测这些细胞包括红细胞、巨噬细胞和成骨细胞（图5B-D）。此外，免疫荧光染色结果显示，骨类器官中CD31、collagen II和periostin高表达，这表明骨类器官在体内培养过程中成功诱导了血管、软骨和骨组织的形成（图5E-F）。
作者进一步展示了骨类器官的晶体学和元素分析。透射电子显微镜（TEM）图像清晰显示了骨类器官内部的超微结构，表明矿物形成具有良好的结晶度，这对于骨状组织的机械性能和生物学功能至关重要（图6A-B）。电子衍射图像进一步揭示了矿化成分的晶体学特征，显示出材料清晰的衍射光环，表明骨类器官中形成了良好的晶体结构（图6C）。EDS分析显示，骨类器官的元素组成中，钙（Ca）和磷（P）的特征峰尤为显著，这与骨组织中羟基磷灰石的成分相符（图6E）。元素分布图则显示了钙（Ca）和磷（P）在矿化区域的局部富集，同时碳（C）和氧（O）的均匀分布也得到了体现，进一步证实了骨类器官中矿化成分与有机基质的结合（图6F）。
最后，作者对骨类器官进行了组织学和免疫荧光染色分析以验证其特性。HE染色和Masson染色展示了骨类器官的整体组织形态、细胞分布以及胶原纤维的排列情况（图7A-B）。ALP染色和ARS染色则突显了该类器官优异的成骨分化能力和较高的矿化程度（图7C-D）。TRAP染色、Oil Red O染色以及Toluidine blue染色分别显示了骨类器官中破骨细胞、脂肪细胞和成软骨细胞的良好分布（图7E-G）。此外，OPN和OCN的免疫荧光染色结果表明，骨类器官的骨矿化过程活跃且成骨细胞分化成熟（图7H-I）。
综上，该研究成功开发了一种结合3D打印技术和BMSC构建具有矿化能力骨类器官的新方法。通过将BMSC与仿骨基质生物墨水混合，并利用光固化3D打印技术，成功构建了骨类器官结构。植入体内模型后，这些结构自发矿化并成熟，形成了完全分化和血管化的骨组织。组织学和免疫荧光染色分析进一步证实了骨类器官的成骨分化、矿化程度以及多种细胞类型的分布。该方法为骨骼生物学研究和治疗应用提供了新的见解和有力工具，具有在骨组织工程和再生医学领域的重要应用潜力。
该研究由上海大学转化医学研究院在读博士王健与博士后周东阳共同担任第一作者，苏佳灿教授、徐可副研究员、白龙副研究员及井莹莹研究员共同担任通讯作者，并于2024年12月1日在线发表于Bioactive Materials。
论文信息：
Wang J, Zhou D, Li R, Sheng S, Li G, Sun Y, Wang P, Mo Y, Liu H, Chen X, Geng Z, Zhang Q, Jing Y, Bai L, Xu K, Su J. Protocol for engineering bone organoids from mesenchymal stem cells. Bioact Mater 2024, 45: 388-400.
